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AML-12細(xì)胞是一種常用于研究肝臟疾病的細(xì)胞系。胚胎干細(xì)胞分泌因子能夠顯著增強(qiáng)AML-12細(xì)胞在惡劣培養(yǎng)條件下的抗凋亡能力,并且還能提高其糖酵解潛力、最大氧化呼吸能力以及氧化呼吸潛力。
AML12細(xì)胞胞體上有黑色顆粒及細(xì)胞胞體上有少量空泡是正常現(xiàn)象。該細(xì)胞培養(yǎng)體系較為特殊且對(duì)血清質(zhì)量較為敏感,并且需要添加ITS,地塞米松維持細(xì)胞狀態(tài),建議使用本庫(kù)配套培養(yǎng)體系(BC-C-MI-M-071)。
細(xì)胞培養(yǎng)步驟 【細(xì)胞復(fù)蘇】 1、取出1mL凍存管后,迅速放入37℃水浴鍋中不斷搖晃使其解凍,直至凍存管中無(wú)結(jié)晶(此過(guò)程盡量在2min內(nèi)完成); 2、準(zhǔn)備15mL離心管,加入2-6mL完培,將凍存管中的細(xì)胞懸液移至離心管,1000 rpm離心3~5min;(比較難養(yǎng)的細(xì)胞可適量增加離心管中的完培) 3、吸棄上清,用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種至無(wú)菌的培養(yǎng)器皿中,輕晃動(dòng)混勻后放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 注:復(fù)蘇第二天若細(xì)胞狀態(tài)較好,但漂浮碎片較多可做換液處理; 復(fù)蘇的細(xì)胞需要時(shí)間恢復(fù)狀態(tài),當(dāng)復(fù)蘇好后密度低于80%時(shí),2天內(nèi)暫時(shí)不要換液,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)恢復(fù)后再進(jìn)行后續(xù)傳代等操作; 【細(xì)胞傳代】 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%,即可傳代培養(yǎng)。 收集細(xì)胞:貼壁細(xì)胞可以參考以下方法1、吸去培養(yǎng)液,加入不含鈣鎂的PBS,輕輕潤(rùn)洗瓶底1-2次,吸棄PBS;2、加入0.25%胰酶-EDTA消化液(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),鋪勻瓶底放入培養(yǎng)箱中消化1-2min;(部分細(xì)胞貼壁較牢,可采用分步消化:將消化下來(lái)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管終止,在培養(yǎng)瓶中加入胰酶繼續(xù)消化,直至大部分細(xì)胞脫落)3、倒置顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞變圓脫落,迅速加入完全培養(yǎng)基終止消化,完培與胰酶比例為2:1;4、輕輕吹打細(xì)胞后吸出轉(zhuǎn)移至離心管中。半貼壁半懸浮細(xì)胞需先收集懸液至離心管再參考貼壁細(xì)胞操作。 離心:收集好的細(xì)胞在1000rpm條件下離心3~5min,離心好后棄除上清液。 接種:準(zhǔn)備好新的培養(yǎng)瓶并添加適量完全培養(yǎng)基,在離心管加入1-2mL完全培養(yǎng)基重懸吹打均勻,初次傳代將細(xì)胞懸液按1:2比例接種到新的培養(yǎng)瓶中,后續(xù)可根據(jù)細(xì)胞實(shí)際情況按1:2-1:4的比例傳代;接種完成后放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 懸浮細(xì)胞建議采用半換液傳代:將培養(yǎng)瓶站立靜置5-10min,肉眼可見(jiàn)細(xì)胞沉底,吸取1/2~2/3上清至離心管離心,將瓶?jī)?nèi)剩余懸液按1:2或1:3的比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶,將離心管中的細(xì)胞重懸后放入培養(yǎng)瓶添加新鮮完全培養(yǎng)基即可。 【細(xì)胞凍存】 收集細(xì)胞參考細(xì)胞傳代步驟。 凍存液重懸:細(xì)胞按照傳代步驟收集細(xì)胞至離心管并計(jì)數(shù),根據(jù)計(jì)數(shù)的密度決定細(xì)胞凍存數(shù)量,一般推薦細(xì)胞凍存密度為1×106-1×107個(gè)活細(xì)胞/管。離心后棄上清,加入配制好的凍存液重懸,分配到凍存管中,每管1mL。 凍存:將凍存管放入程序降溫盒中進(jìn)行梯度降溫,然后放入-80℃冰箱降溫,24h后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐中。若沒(méi)有凍存盒,可于冰箱4℃放置30min,隨后轉(zhuǎn)移至-20℃冷凍2h,接下來(lái)將其放于-80℃超低溫冰箱中過(guò)夜,最終放置于液氮中以長(zhǎng)期保存。 參考文獻(xiàn):[1]林武,黃昭帥,鮑苗,等.胚胎干細(xì)胞分泌因子增強(qiáng)AML-12細(xì)胞抗凋亡能力[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2018,48(06):408-412.