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BIOCHANNEL 科普 | 雜交瘤細胞如何建立

什么是雜交瘤技術?

雜交瘤技術是一種用于生產(chǎn)單克隆抗體的生物技術,由Georges Kohler和César Milstein于1975年發(fā)明,并因此獲得了1984年的諾貝爾獎。該技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征:一種是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細胞(B淋巴細胞),另一種是具有無限分裂能力的小鼠骨髓瘤細胞。

具體來說,B淋巴細胞在受到特定抗原刺激后,可以大量增殖并分泌針對該抗原的特異性抗體,但這些細胞在體外環(huán)境下存活時間較短;而骨髓瘤細胞則可以在培養(yǎng)條件下無限分裂和增殖,即具有所謂的永生性。通過將這兩種細胞進行融合,可以形成一種新的細胞——雜交瘤細胞。這種細胞既保留了B細胞的抗體分泌功能,又具備了骨髓瘤細胞的永生性,能夠在選擇性培養(yǎng)基中持續(xù)生長和繁殖。

雜交瘤技術的操作流程通常包括以下幾個步驟:

? 免疫小鼠:首先對小鼠進行免疫接種,使其產(chǎn)生針對特定抗原的抗體。

? 分離脾細胞:從免疫后的小鼠體內(nèi)提取脾臟,并從中分離出B淋巴細胞。

? 融合細胞:將這些B細胞與骨髓瘤細胞進行融合,通過使用聚乙二醇(PEG)作為融合劑,使兩者結(jié)合形成雜交瘤細胞。

? 篩選雜交瘤細胞:將融合后的細胞在含有次黃嘌呤、氨甲蝶呤和胸腺嘧啶(HAT)的選擇性培養(yǎng)基中進行篩選,以淘汰未融合或非目標細胞,保留能夠生長且能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞。

? 二次篩選:進一步通過有限稀釋法將雜交瘤細胞接種在多孔板上,每孔不超過一個細胞,通過培養(yǎng)讓其增值,然后檢測各孔上清液中抗體的特異性,最終確定陽性克隆。

雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)

系統(tǒng)的腹水法已逐漸被體外大規(guī)模培養(yǎng)所取代,這包括懸浮培養(yǎng)、微載體懸浮培養(yǎng)、微囊培養(yǎng)以及中空纖維培養(yǎng)等方法。這些方法不僅提高了單克隆抗體的產(chǎn)量,還便于質(zhì)量控制和標準化生產(chǎn)。

雜交瘤細胞體外培養(yǎng)的工藝流程一般分為以下幾個階段:

? 細胞選擇與融合:首先從免疫動物中獲取B淋巴細胞和骨髓瘤細胞,通過PEG誘導劑進行細胞融合,形成雜交瘤細胞。

? 篩選與克隆化:將融合后的細胞接種到含有HAT培養(yǎng)基的96孔板中進行篩選,只有成功融合的雜交瘤細胞才能在該培養(yǎng)基中生長。

? 工藝優(yōu)化:根據(jù)具體需求,對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,如調(diào)整培養(yǎng)基成分、改變攪拌速度等,以提高雜交瘤細胞的生長密度和抗體產(chǎn)量。

? 純化與收獲:最后通過收集培養(yǎng)上清液并離心去除細胞碎片,得到所需的單克隆抗體

雜交瘤技術的特點

1. 能夠生產(chǎn)大量均一的單克隆抗體,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且親和力較好。

2. 可以永久傳代和大規(guī)模生產(chǎn)抗體。然而,該技術也存在一些局限性:周期較長,需要經(jīng)過兩次篩選過程。

3. 存在遺傳異質(zhì)性問題,可能影響抗體的一致性和效能。

4. 需要合適的培養(yǎng)基和設備維護。

總之,雜交瘤技術不僅為單克隆抗體的生產(chǎn)提供了穩(wěn)定可靠的平臺,也為免疫學和生物醫(yī)學領域的發(fā)展做出了重要貢獻。

注意事項

細胞損傷與保護:在高密度培養(yǎng)過程中,細胞可能會受到機械損傷或氧化應激的影響,需要采取相應的保護措施。

無血清培養(yǎng):雖然無血清培養(yǎng)基可以減少雜質(zhì)污染和動物病毒的風險,但其適應性較弱,需要逐步馴化雜交瘤細胞。

放大與擴增:在放大培養(yǎng)過程中,需要考慮攪拌條件、容器大小等因素,以保證細胞的均勻生長和抗體的一致性。


隨著生物反應器技術的發(fā)展,雜交瘤細胞的大規(guī)模體外培養(yǎng)已經(jīng)取得了顯著進展。例如,英國Celltech公司開發(fā)的1萬升氣升式反應器已成功應用于單克隆抗體的生產(chǎn)。國內(nèi)也有類似規(guī)模的生物反應器用于WuT3雜交瘤細胞的培養(yǎng)。

總之,雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)技術在單克隆抗體生產(chǎn)中發(fā)揮著至關重要的作用。通過不斷優(yōu)化培養(yǎng)條件和工藝流程,可以有效提高抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量,滿足臨床和科研的需求。